EZ-1700 HIV-1整合酶检测试剂盒操作方案

一、说明

HIV整合酶可以将HIV DNA整合入宿主细胞DNA，因此，整合酶成为艾滋病研究的潜在靶标。

按照实验方案，向预包被链霉亲和素的96孔板依次加入：

　a)DS DNA（double-stranded HIV-1 LTR U5 donor substrate DNA，末端生物素标记）

　b)全长的重组HIV-1整合酶

　c)抑制剂或实验样品

　d)TS DNA（double-stranded target substrate，3’-末端修饰）

　e)TMB 底物

　f)终止液

催化反应：HIV-1整合酶催化从DS DNA向TS DNA的核酸链转移重组反应

检测反应产物：加入HRP-标记的抗体 + TMB底物

二、试剂盒组分

★ 在上述储存条件下，试剂盒可以稳定保持1年。

★ 打开箔片包装袋后，本次实验未使用的微孔板条须密封好，放回箔片包装袋中，储存于2~8℃。

★ 实验之前，反应缓冲液（2 ml /孔）应该添加14.5 M β-巯基乙醇（BME 0.4 μl/1 ml）激活。BME激活的反应缓冲液可以在2~8℃稳定保持1周。储存期间，反应缓冲液可能出现沉淀，所以使用之前，反应缓冲液可以 37℃水浴。

三、实验前注意事项

一般建议：

开始试验之前，请仔细阅读操作方案，因为细微的差错就会影响最终结果。为了得到优良的结果，请优先使用板内部的、近中心的孔。z

配置洗液：

提供的是20×，使用之前，混匀50 ml 浓缩洗液 + 950 ml灭菌蒸馏水，稀释至1×。

反应缓冲液：

该缓冲液含有锰、镁。使用之前，添加0.4 μl/1 ml 2-ME激活。每孔需要使用反应缓冲液 2 ml。只激活本次实验使用的这一份反应缓冲液，而不要把整瓶220 ml 反应缓冲液一次全部激活。取用之前，轻轻把瓶子摇匀。

DS and TS DNAs：

提供的是100×。使用之前，用反应缓冲液稀释100倍至1×。TS DNA易于粘附离心管壁。

HIV-1 整合酶：

每次使用之前置于冰上解冻，保证酶的稳定。

洗板：

可以人工洗，也可以用自动洗板机洗。每次洗后，轻轻拍打，完全除去孔内的残液。

复孔：

建议所有样品和对照都做2~3个重复。

四、操作流程

DS 包被 和 SA 板封闭

1. 复温：

实验之前，反应缓冲液、封闭液 37℃水浴10 min。除了HIV-1 整合酶（置于冰上解冻），其余试剂都复温至室温。

2. 包被DS DNA

本次未使用的板条重新密封好，放回箔片包装袋。用反应缓冲液稀释本次使用的DS DNA至1×（10 μl DS DNA 100× 溶液 + 990 μl 反应缓冲液）。每孔加入100 ml 1× DS DNA，37℃培养箱孵育30 min。反应缓冲液放回37℃水浴。

3. 封闭

吸去孔内液体，用300 μl 1× 洗液洗5次。每孔加入200 μl 封闭液，37℃培养箱孵育30 min。

如果需要，板可以置于2~8℃过夜，在稍晚接着方案做实验之前，37℃培养箱孵育20 min即可。但是如果在一天之内连续做完，实验结果会更好。

整合酶反应

4.将整合酶加入 DS DNA孔

使用之前，HIV-1 整合酶置于冰上或2~8℃解冻（大约5 min），快速离心管子（例如10000 RPM × 5 sec）。用反应缓冲液以1︰300稀释（2 μl HIV-1 整合酶 + 598 μl 反应缓冲液）。吸去孔内液体，用200 μl 反应缓冲液洗3次。每孔加入100 μl 反应缓冲液（阴性对照）或整合酶溶液（阳性对照），37℃培养箱孵育30 min。反应缓冲液放回37℃水浴。

5. 加抑制剂和检测物

制备实验样品：用反应缓冲液稀释至2×最终要求的实验样品浓度。例如，当实验要求的样品最高浓度是10 μM或10 μg/ml时，用反应缓冲液制备20 μM或20 μg/ml的样品，以及系列稀释。叠氮钠稀释至0.30%（2×浓度或0.15%最终1×浓度），抑制大约50%整合酶活性。

吸去孔内液体，用200 μl 反应缓冲液洗3次。每孔加入50 μl对照，或用反应缓冲液制备的50 μl 实验样品（negative control）或整合酶溶液（positive control），室温孵育5 min。

6. 加入 TS DNA

用反应缓冲液稀释本次使用的TS DNA至1×（10 μl TS DNA 100× 溶液 + 990 μl 反应缓冲液）。每孔直接加入50 ml 1× TS DNA。轻轻敲打以混匀。37℃孵育30 min。

检测反应

7. 加 HRP-抗体

吸去孔内液体，用300 μl 洗液洗5次。每孔加入100 μl HRP 抗体，37℃孵育30 min。

8. 加入TMB 底物

吸去孔内液体，用300 μl 洗液洗5次。每孔加入100 μl TMB 过氧化物酶底物 溶液，室温孵育10 min。

9. 加入 TMB 终止液

孔中直接加入100 μl TMB 终止液。用枪头弄破任何较大的气泡。用读板机以最小0.1 sec读取450 nm处吸光度。加入TMB 终止液后，应该在10 min内读板。

如果OD450吸光度超过了读板机的范围，为了实现更准确的读数和数值终点，可以将反应物稀释。将100 μl 反应液 + 100 μl 去离子水加入稀释板（无 SA-coated），读取450 nm处吸光度。此稀释样品的吸光值应该乘以2。