免疫组化标准方案 （福尔马林固定石蜡包埋）

1. 实验材料

(1) PBS

(2) Clearing and rehydration试剂：Histoclear II、100%、90%和70% 酒精

(3) 热诱导表位恢复试剂试剂（Heat induced epitope retrieval; HIER）：10mM柠檬酸钠，PH6.0

(4) 抗原恢复试剂（Antigen retrieval）：蛋白酶K和胰蛋白酶

(5) 内源性过氧化酶封闭液：0.3%H2O2

(6) 封闭液：含10%FBS的PBS，FBS种属与二抗来源种属一致

(7) 一抗：纯化或生物素化规格（供二步法使用）

(8) 二抗：生物素化。（供三步法用）

(9) 放大剂：抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶（cat#18-4100）

(10) 显色剂:30% H2O2储液，二氨基联苯胺（DAB）1%储液。

(11) 细胞核复染试剂：苏木素（Hematoxylin）

(12) 包埋剂：封盖胶（Fisher Scientific）

2. 实验方案

(1) 石蜡包埋，切片。

(2) 50-60度烤箱中干燥烘烤20分钟（注意：温度不能超过60度以免破坏靶抗原）。

(3) 对载玻片进行如下洗涤和孵育程序，以除去石蜡和水化：Histoclear II 3 x 5 分钟, 100% Ethanol 2 x 5 分钟, 90% Ethanol 1 x 5 分钟, 70% Ethanol 1 x 5 分钟, ddH2O 1 x 5 分钟（注意：充分浸入，除去气泡，避免组织过分干燥以免影响后续染色）。注：若抗原在固定时容易交联（影响一抗的特异性），则需要蛋白酶消化或枸橼酸盐缓冲液中加热除去交联。抗原修复方法依照靶抗原选择，建议没有修复的和修复后的抗原同时进行。

(4) （可选）热修复抗原表位（HIER）：将玻片完全浸没于修复液中，微波加热煮沸15min，再置于枸橼酸盐缓冲液中冷却至室温。

(5) （可选）抗原修复（蛋白消化法）：将玻片浸入蛋白酶K或胰蛋白酶中，37度孵育20min，冷却至室温。

(6) 用 PBS小心洗涤两次，每次5分钟，浸没，低速摇晃。

(7) 如果最后要使用过氧化物酶显影，则将玻片浸入0.3%H2O2中室温15-40min，除去过氧化物酶。注意：个别组织孵育时间依照过氧化物酶含量调整。

(8) 用 PBS小心洗涤三次，每次5分钟，浸没，低速摇晃。

(9) 用10%的正常血清封闭组织上非特异性位点，100-150ul/slide，室温封闭1小时，为防止封闭液蒸发，可以使用石蜡封口膜轻轻覆盖切片，避免拉伸和产生气泡，置然后于湿盒中。

(10) 用镊子小心的除去封口膜，将玻片用 PBS小心洗涤1次，每次5分钟，浸没，低速摇晃。