流式分析样品的准备

流式一、

样品的准备

试验一：组织培养细胞的细胞准备

材料 　　

AccutaseTM Enzyme Cell 完全培养基（eBioscience Cat.No. 00-4555）　　流式细胞仪染色液（eBioscience Cat.No. 00-4222）　　15或50ml尖底离心管

实验过程

1． 对于悬浮培养的细胞，把细胞分装到一个尖底离心管中，对细胞进行计数和活性分析，然后进入步骤3；

2． 对于贴壁培养的细胞，建议用AccutaseTM Enzyme Cell 完全培养基从培养皿上吹起并吹散细胞凝聚物，然后把细胞分装到一个尖底离心管中，对细胞进行计数和活性分析，进入步骤3；

3． 离心细胞然后用流式细胞仪染色液重悬细胞使其终浓度为2×107个细胞/ml。

试验二：淋巴组织的细胞准备

材料　　

60×15 mm 组织培养皿　　

3 ml注射器　　

细胞滤网（血液尼龙滤网）　　

流式细胞仪染色液（eBioscience Cat.No. 00-4222）　　

15或50ml尖底离心管

实验过程

1． 采集组织（采集组织（脾，淋巴结，胸腺）放进一个细胞培养皿中，用3 ml注射器的活塞挤压以制成单细胞悬液，此过程用10ml的染色缓冲液；

2． 加入10ml染色液收集细胞，使细胞悬液通过尼龙滤网以除去成团的细胞和细胞碎片，收集细胞悬液于尖底离心管中；

3． 4℃离心细胞悬液4-5分钟（300-400g），弃掉上清液；

4． 重悬细胞沉淀，细胞计数和活性分析；

5． 按照步骤3离心细胞然后用合适体积的染色液重悬细胞，使细胞终浓度为2×107个细胞/ml。

试验三：非淋巴组织的细胞制备

材料　　

剪刀或者手术刀片　　

PBS 　　

60×15 mm 组织培养皿　　

3 ml注射器　　

细胞滤网（血液尼龙滤网）　　

流式细胞仪染色液（eBioscience Cat.No. 00-4222）　　

15或50ml尖底离心管　　

实验过程

1． 采集组织，用剪刀或手术刀切成2-4mm的小块；

2． 按照酶的使用说明书，加入适量用PBS稀释的酶，孵育。酶的选择可以参照以下网站：http://www.tissuedissociation.com；

3． 用移液管轻轻吹散细胞，并用滤网过滤除去成团的细胞和细胞碎片；

4． 4℃离心细胞悬液4-5分钟（300-400g），弃掉上清液；

5． 用PBS重悬细胞沉淀以移除剩余的酶溶液；

6． 重复步骤4；

7． 重复步骤5和6；

8． 用流式染色液重悬细胞沉淀，细胞计数和活性分析；

9． 按照步骤4离心细胞然后用合适体积的染色液重悬细胞，使细胞终浓度为2×107个细胞/ml。

试验四：

材料　　

PBS 　　

FicollTM或其它的培养基　　

流式细胞仪染色液（eBioscience Cat.No. 00-4222）　　

15或50ml尖底离心管实验过程

1． 在尖底离心管中用PBS按1:1的比例稀释血样；

2． 用FicollTM 等倍稀释样品；

3． 离心20分钟；

4． 收集PBS和FicollTM交界处的PBMC；

5． 在试管中加入PBS；

6． 4℃离心细胞悬液4-5分钟（300-400g），弃掉上清液；

7． 用流式染色液重悬细胞沉淀，细胞计数和活性分析；

8． 按照步骤6离心细胞然后用合适体积的染色液重悬细胞，使细胞终浓度为2×107个细胞/ml。 　　

用淋巴组织细胞悬液在流式细胞仪上分析以前，最好去掉红细胞。

试验一：鼠脾细胞中红细胞的裂解：

材料　　

1×PBS 　　

eBioscience 红细胞裂解液(Cat.No.00-4333) 　　

50ml 尖底管

1． 采集小鼠的脾脏并且制成单细胞悬液；

2． 4℃ 离心沉淀细胞（300-400g），弃掉上清液；

3． 用5ml脾的红细胞裂解液重悬细胞；

4． 室温震荡孵育4-5分钟（也可在冰上进行）；

5． 加入20-30ml PBS 停止反应；

6． 4℃ 离心沉淀细胞（300-400g），然后用合适体积的缓冲液重悬细胞沉淀，继续下一步试验；

7． 细胞计数。

试验二：小鼠血液的红细胞裂解

材料　　

1×PBS 　　

eBioscience 红细胞裂解液(Cat.No.00-4333) 　　

50ml 尖底管

1． 1ml小鼠血液中加入10ml 红细胞裂解液；

2． 室温震荡孵育4-5分钟（也可在冰上进行）；

3． 加入20-30ml PBS 停止反应；

4． 4℃ 离心沉淀细胞（300-400g），然后用合适体积的缓冲液重悬细胞沉淀，继续下一步试验；

5． 细胞计数。

试验三：人外周血中红细胞的裂解

材料　　

1×PBS 　　

eBioscience 红细胞裂解液(Cat.No.00-4333) 　　

50ml 尖底管

1． 1ml人的血液中加入10ml 红细胞裂解液；

2． 室温孵育10分钟（不要超过15分钟）；

3． 加入20-30ml PBS 停止反应；

4． 4℃ 离心沉淀细胞（300-400g），

然后用合适体积的缓冲液重悬细胞沉淀，继续下一步试验；

5． 细胞计数。