Platinum ELISA 参考实验方法

（以BMS606 mouse IFN-gamma ELISA为例）

注意事项：

1. 试验中使用特定试剂盒的标准品和抗体，不建议不同试剂盒产品调换，因为可能影响结果准确性。

2. 稀释用的缓冲液中不能含有叠氮化钠，因为其可以灭活辣根过氧化物酶。

3. 储存或孵育时避开强光。

4. 注意人员防护，避免试剂接触皮肤。

5. 底物溶液避免接触氧化剂和金属。

6. 底物使用前请平衡至室温。

7. 缓冲液稀释后有效期为一个月，放大液现用现配（配好立即加到板子中）。

储存和稳定性说明

1. 试剂盒提供冻结的标准品，对照干粉和平板，收到后请存于4~8度冰箱，有效期见标签。

2. 重复使用试剂请避免污染。

1. 本试剂盒适用血清和细胞培养上清。

2. 取血清时注意凝结后立即取出血清冻存于-20摄氏度一下，避免IFN-gamma活性降低。

3. 样品出现沉淀请离心去除，避免影响实验结果。

4. 严重溶血或高血脂样品不能使用。

5. 避免样品反复冻融，使用前平衡至室温，小心混匀。

试剂准备：

1. 1×Washing buffer：50ml 20×washing buffer concentrate+950ml ddH2O 混合均匀，4~25摄氏度保存一个月。

2. Assay buffer 用水稀释为1×。

3. 用1×assay buffer 稀释biotin-检测抗体100：1.

4. 用1×assay buffer 稀释streptavidin-HRP 100:1

标准品稀释（如下图）

1. 按照C of A说明使用无菌双蒸水配制浓度为2ng/ml 的标准品溶液，四度平衡混匀10—30min。

2. 使用1xAssay Buffer按如下方案稀释（1：2）

小心混匀，终浓度为1000pg/ml.

3. 在ELISA板子中从A1和A2开始到H1和H2每孔分别加入100ul检测稀释液。

4. 取100ul的浓度为2000pg/ml的标准品加入到A1和A2两个孔中。

5. 用排枪从A1和A2两个孔中吸取100ul加入到对应的B1和B2中，吹吸混合均匀，那么 B1和B2标准品浓度为500pg/ml。

6. 从B1和B2中吸取100ul加入到C1和C2孔中，混匀，那么C1和C2孔标准品浓度为250pg/ml。

7. 按照步骤4和5的方法倍比稀释到G1和G2两孔。G1和G2孔中标准品的浓度是15.6pg/ml，体积为225ul。

注意：4到6步骤稀释速度要快，避免时间过长，建议使用多通道排枪进行。

8. 设置H1和H2为空白对照（只加100ul稀释液），为了避免胡克效应的影响，我们建议可以采用A1和A12作为空白对照孔，而不设置样品或标准品。

实验材料：

1. 铝铂包预包被mouse IFN-抗体的ELISA板。

2. 100ul结合生物素的anti-mouse IFN-检测抗体。

3. 2瓶mouse IFN-标准品干粉，2ng/ml以上浓度重悬。

4. 10×ELISA包被缓冲液。

5. 1瓶12ml样品稀释液。

6. 1瓶检测浓缩液（20X）5ml（1XPBS+1%Tween20+10%BSA）。

7. 1瓶浓缩洗液（50ml,20X,1XPBS+1%Tween20）

8. 1瓶底物（15ml）

9. 1瓶终止液（15ml,1M 磷酸）

10. 封板膜

11. 蓝色、绿色和红色三瓶染料（各0.4ml）

仪器

1. 吸管和单通或多通移液器

2. 冰箱

3. 排枪水槽

4. 分光光度计

5. 洗板机

实验流程：

注意：孵育时间和洗涤次数请严格按照说明书执行，不得随意更改。

放大液要使用之前现配先用，不得预先配置，洗涤效果对结果至关重要。

1. 取出板子，安排样品，标准品排布顺序。

2. 用400ul1×洗液洗涤ELISA板子两次，每次10—15s(小心不得抓板孔表面，洗涤间歇不得过大，不能使板孔晾干)。

3. 按下图稀释标准品(在培养板中稀释)。

4. 加100ul样品稀释液至H1，H2孔中。

5. 加50ul 样品稀释液到样品孔中，加50ul样品到样品孔中。

6. 准备生物化抗体（检测抗体），所有孔中各加50ul，封板室温（18-25摄氏度）震荡(100rpm/min)孵育2h。

7. 准备抗生物素的HRP，弃掉板子中液体，并用洗液洗涤3次。

8. 向所有孔中个加100ul稀释好的HRP，封板室温（18-25摄氏度）震荡(100rpm/min)孵育1h。

9. 弃掉板子中液体，并用洗液洗涤3次，向所有孔中个加100ulTMB底物。封板室温（18-25摄氏度）孵育10-20min，每孔加100ul终止液。

10. 450nm读板。

结果计算：（需要从标准品OD值拟合出来方程来推算样品的细胞因子的含量）。

1. 计算标准品，空白和样品孔平均OD值。

2. 样品OD值减去空白孔平均OD值。

3. 利用软件拟合出4参数的对数标准曲线，也可以使用描点的方法在坐标中描绘出X轴为标准品浓度，Y轴为平均OD值的各个点，然后大致拟合出相应的曲线。最佳的方法是使用回归分析的方法拟合出标准曲线。

4. 利用标准曲线拟合的公式去计算样品中细胞因子的浓度。

5. 如果在实验前样品经过稀释，则结果需要乘于稀释倍数。