调节性T细胞（Treg）及其流式检测方法

1、Treg细胞概述

　　高效免疫抑制剂的发现及其联合应用使临床器官移植的急性排斥反应大大降低，移植物的存活时间明显延长；器官移植成为挽救终末期器官功能衰竭患者生命的重要有效途径。但是免疫抑制剂具有明显的毒副作用(如对重要脏器的损伤、降低抗肿瘤及抗感染免疫力等)及对治疗慢性排斥反应效果较差等问题，均限制了免疫抑制剂的长期应用。因此，相关生命科学工作者尝试通过诱导移植免疫耐受途径来避免免疫抑制剂的长期应用及克服移植免疫排斥反应。

在上个世纪九十年代中期，由Sakaguchi等首先证实了天然CD4+ CD25+ 调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)为一类具有免疫抑制作用的T细胞，约占外周血单个核细胞（PBMC）2%～5%，约占外周CD4+T细胞的5～10%。该类细胞以“主动”的方式参与免疫应答／免疫耐受的调控，不仅参与自身免疫耐受调节，而且在肿瘤免疫和移植免疫中也具有重要的作用。

2、Treg细胞的来源

　　研究证实，天然的CD4+CD25+Treg细胞来源于胸腺，小鼠出生后第3天切除胸腺，外周缺乏CD4+CD25+Treg细胞，产生抗自身抗体并出现自身免疫性胃炎等自身免疫性疾病。而在第0天和第7天切除胸腺，并不表现自身免疫性疾病。这说明出生3d内是胸腺产生CD4+CD25+Treg细胞的关键时期，这时切除胸腺引起自身反应性CD4+T细胞的过度增殖。但是，出生第0天胸腺产生的自身反应性CD4+T细胞不足，出生第7天胸腺已经产生了足够的CD4+CD25+Treg细胞，所以这时切除胸腺， 小鼠不出现自身免疫性疾病。Papiernik等证实，CD4+CD25+Treg细胞产生于胸腺，然后迁移到外周发挥作用，CD4+CD25+胸腺细胞与外周的CD4+CD25+Treg细胞一样，表现对经由TCR的抗原刺激呈低反应性，并且显示抑制其他T 细胞增殖的能力。CD4+CD25+Treg细胞的产生需要TCR与胸腺皮质上皮细胞的MHC II类分子间的高亲和力作用，MHC II类分子缺陷的小鼠缺乏CD4+CD25+Treg细胞。CD4+CD25+Treg细胞除了在胸腺产生以外，还可以在未成熟的树突状细胞、IL-10、IFN-a、TGF-beta或者低剂量抗原诱导下由外周CD4+CD25-细胞转变而来，该类细胞称为诱导的CD4+CD25+Treg细胞。

3、Treg细胞的常用的分子标记

　　①CD25：Treg细胞调节机体免疫系统平衡，增加免疫耐受。研究表明，多种T细胞分子抗原参与Treg细胞的特异性功能效应。传统鉴定Treg细胞主要是通过CD4和CD25来标记。但随着研究的进一步深入，发觉只通过CD4+CD25+双阳性来定义的Treg细胞并不完全准确。

②FOXP3： FOX(forkhead box)是脊椎动物叉头样转录因子的总称，是一个具有多种功能的转录因子大家族，通常和细胞生长发育的调控有关。FOX家族成员都有一个叉头样结构域，能与DNA结合。FOXP3是叉头样转录因子家族中的成员，2001年由Brunkow等首次报道。研究发现，它的表达及功能与调节性T细胞(regulatory T cells，TR细胞)密切相关。如果FOXP3基因发生突变，将影响TR细胞的发育成熟，导致IPEX综合征(immune dysregulation，polyendocrinopathy，enteropathy，X-linked syndrome)。

　　FOXP3主要表达于胸腺、脾脏和淋巴结等淋巴器官和组织。在小鼠特异性表达于CD4+CD25+T细胞，而不表达于CD8+T细胞。在人类FOXP3不仅可表达于CD4+CD25+T细胞，还可表达于CD8+CD28-T细胞。但在CD4+T细胞中的表达明显高于CD8+T细胞。目前，Foxp3(forkhead box P3，Scurfin)是目前公认的Treg细胞的最敏感的标志。

③CD127：最近发现通过表达CD4，CD25和传导信号FoxP3来定义调节性T细胞时，在一类特殊的细胞群体时会出现问题。我们发现IL-7受体（CD127）在外周血CD4+T的一个亚群中会下调表达。我们证实这些细胞FoxP3阳性，且这群细胞包括那些CD25弱阳性或阴性群体。联合使用　　CD4，CD25和CD127可得到高纯度的调节性T细胞，比以前的通过其他标志物来区分方法显著提高。这些细胞在功能抑制实验中可发挥高度抑制功能。实际上，通过CD4和CD127表达来区分的细胞数量（包括CD25+CD4+和CD25-CD4+）三倍于通过CD4+CD25hi区分的调节性T细胞亚群。最后，我们使用CD127定量检测I型糖尿病病人调节性T细胞，发现CD127可作为人调节性T细胞的标志物。

4、FOXP3流式检测方法

　　美国eBioscience公司是最早拥有FOXP3流式检测抗体的公司之一，公司通过不断改进和优化，建立了一套完美的针对FOXP3流式检测特殊的试剂和方案。

（1）实验材料

实验设备

1) 流式上样管 

2) 混匀振荡器

3) 离心机

4) 移液器、Tips

5) 流式细胞仪

所需试剂 

1) 细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂（CD4、CD25或CD8等）

2) FOXP3荧光标记抗体

3) 溶血素：（eBioscience目录号00-4333）用于裂解红细胞

4) 淋巴细胞分离液：若样品为人的全血，建议先用分离液分离出单个核细胞后再做后续检测

5) 固定剂和破膜剂：（eBioscience FOXP3检测专用试剂，目录号为00-5521或00-5523；在FOXP3染色前，将其中的Fixation/Permeabilization Concentrate和Fixation/Permeabilization Diluent以1：3的比例混合，配制好的溶液保存时间不要超过一天）

6) 其他试剂：Flow Cytometry Staining Buffer（00-4222）或PBS，Permeabilization Buffer（Cat.No 00-8333）等

（2）实验操作步骤

注：对于不同的FOXP3克隆号抗体，在操作上可能存在着一些细微的差别。具体实验时，请参考相应的抗体说明书上的操作步骤。此操作以人Foxp3 (clone PCH101, cat. XX-4776).为例。

1、按照流式样品要求制备单细胞悬液。

2、按照流式表面染色方法标记CD3和CD4。缓冲液洗涤一次，离心完全弃上清。斡旋分散细胞。

3、加1ml Foxp3 Fixation/permeabilization 工作液，斡旋固定细胞。室温或四度避光孵育30-60min（小鼠样品最长可以四度固定18小时）。

4、每管加2ml 1×permeabilization buffer。

5、300g 室温离心5min,弃上清。

6、2ml 1×permeabilization buffer重悬细胞。

7、300g 室温离心5min,弃上清。

8、加100ul 1×permeabilization buffer 重悬细胞后，加入二抗FOXP3 （或其他胞内抗原抗体），室温避光孵育20min。

9、2ml 1×permeabilization buffer洗一次，300g 室温离心5min,弃上清。

10、加2ml 流式染色液，300g 室温离心5min,弃上清。

11、适量流式染色液重悬，即可上机检测。同行对照依照上述步骤进行。软件分析结果。

　　注：在染胞内或胞核内的因子时，要对细胞进行固定和破膜，因此，与活细胞相比，在形态上会有一定变化，因此必须对所有细胞样本进行固定和破膜；若对Blank和染色细胞没做固定和破膜，在FSC/SSC图中对固定和破膜的样品细胞圈门时需要做一定调整。