eFluor® 纳米晶体免疫荧光染色（冰冻切片）

1. 材料：

(1) TBS（Tris buffered saline）:5mM Tris，150mM Nacl，PH 7.4。

(2) 丙酮：分析纯

(3) 封闭液：含10%FBS或1%BSA的TBS，FBS种属与二抗来源种属一致。

(4) 一抗：纯化或生物素化规格。

(5) 二抗：生物素化。

(6) 显色剂：抗生物素的eFluor 605NC（CAT#93-2317）或抗生物素的eFluor 650NC（CAT#95-2317）。

(7) 包埋剂：Fluoromount-G（southernBiotech）or Fluoro-Gel（EMS）。

(8) 湿盒。

2. 方案：

(1) 切片空气干燥10min。

(2) 浸入丙酮固定10min。

(3) TBS室温水化10min。注意：组织不能脱水，否则不利于染色。

(4) 室温封闭1小时（100ul/组织），盖膜防止蒸发。注意：PAP笔可能会干扰eFluor荧光在此不建议使用。

(5) 用镊子小心移去膜，TBS，慢速振荡洗涤3次，每次5min。

(6) 用封闭液按照说明书稀释一抗，加一抗湿盒中室温孵育2小时。低丰度的抗原一般4度孵育12小时以上。

(7) TBS洗3次，方法同上。

(8) 按建议浓度稀释二抗，室温孵育1小时。

(9) TBS洗3次，方法同上。

(10) 按建议浓度（1:100）稀释显影剂：抗生物素的eFluor 605NC（CAT#93-2317）或抗生物素的eFluor 650NC（CAT#95-2317）。室温避光孵育30min。

(11) TBS洗3次，方法同上。

(12) 封片，4度避光保存或直接观察拍照。