Instant ELISA 实验步骤

——以human IL-6 instant ELISA为例（cat#BMS213INST）

注意事项：

1. 试验中使用特定试剂盒的标准品和抗体，不建议不同试剂盒产品调换，因为可能影响结果准确性。

2. 稀释用的缓冲液中不能含有叠氮化钠，因为其可以灭活辣根过氧化物酶。

3. 储存或孵育时避开强光。

4. 注意人员防护，避免试剂接触皮肤。

5. 底物溶液避免接触氧化剂和金属。

6. 底物使用前请平衡至室温。

7. 缓冲液稀释后有效期为一个月。

储存和稳定性说明

1. 试剂盒提供冻结的标准品，对照干粉和平板，收到后请立即冻存于-20度冰箱，有效期见标签。

2. 重复使用试剂请避免污染。

样品及收集注意事项

1. 本试剂盒适用血清和细胞培养上清。

2. 取血清时注意凝结后立即取出血清冻存于-20摄氏度一下，避免IL-6活性降低。

3. 样品出现沉淀请离心去除，避免影响实验结果。

4. 严重溶血或高血脂样品不能使用。

5. 避免样品反复冻融，使用前平衡至室温，小心混匀。

实验材料：

1) 预包被human IL-6抗体的微孔板+结合生物素的检测抗体+抗生物素的辣根过氧化物酶。+Human IL-6标准曲线。

2) 25ml 浓缩wash buffer 20×。

3) 12ml样品稀释液。

4) 15ml TMB底物(四甲基联苯胺)。

5) 15ml 终止液：1M H3PO4 或者2N H2SO4

6) Control high 一瓶（冻干粉）。

7) Control low 一瓶（冻干粉）。

8) 封口膜。

仪器

吸管和单通或多通移液器

冰箱

排枪取液水槽

酶标仪

洗板机

准备试剂和样品

1) 将浓缩洗液（20×）平衡至室温，稀释为1×。

2) Control 干粉处理：加300ul 双蒸水小心重悬干粉10~30min，使其完全溶解，使用前请小心混匀。按照C of A 处理control 范围，重悬后的液体储存于-20摄氏度，避免反复冻融。

实验流程：

注意：

★ 从-20℃冰箱取出板子后立即使用，防止变质。

★ 小心除去standard孔膜，是冻干粉沉在底部，避免膜带走干粉。

★ 加入双蒸水后无需等待其完全溶解即可进行下一步实验。

★ 严禁用TIP头混匀孔内溶液，因为会沾走试剂影响结果。

★ 400ul洗液洗板，洗涤除去孔壁粘附的残留物，以免影响实验结果。

1 按照试验计划准备孔板A1/A2¬~H1/H2（如表1）。

2 按照标签所示，向standard 和blank孔加入50ul（标签所示）双蒸水(A1/A2¬~H1/H2)。

3 向样品孔中加入100ul 双蒸水。

4 向样品孔加入样品25ul ，包括复孔，小心混匀。

5 封口膜封板，室温（18—25摄氏度）孵育2小时，200rpm，震荡（若不震荡所得的OD值可能偏低，但是仍然可用）。

6 弃掉液体，加400ul洗液，15s左右，弃掉排干，重复3次（避免孔过于干燥）。

7 向各孔加TMB底物100ul，室温避光孵育10min，观察显色最佳时间（标准品最高浓度变为深蓝色或阳性对照不再有变化的时候）。

8 迅速加入100ul 终止液终止酶反应，2~8度避光1h内检测读板。

结果计算：（需要从标准品OD值拟合出来方程来推算样品的细胞因子的含量）。

1. 计算标准品，空白和样品孔平均OD值。

2. 样品OD值减去空白孔平均OD值。

3. 利用软件拟合出4参数的对数标准曲线，也可以使用描点的方法在坐标中描绘出X轴为标准品浓度，Y轴为平均OD值的各个点，然后大致拟合出相应的曲线。最佳的方法是使用回归分析的方法拟合出标准曲线。

4. 利用标准曲线拟合的公式去计算样品中细胞因子的浓度。

5. 如果在实验前样品经过稀释，则结果需要乘于稀释倍数。