InstantOne ELISA 参考实验方法

注意：试剂盒组成和缓冲液制备、稀释及储存条件请参考试剂盒说明书，本方案不在赘述。

实验方案一

A． 样品制备

贴壁细胞

1. 小心除去细胞培养基，用PBS洗涤细胞一次，若细胞培养于96孔板，加入100ul新鲜配制的1x Cell Lysis Mix 裂解细胞，300转/min 室温震荡裂解10min。

注意：裂解液体积需要依据裂解物浓度调整。一般裂解物中蛋白含量在0.1—0.5mg/ml就足够实验检测。但是制备高浓度的裂解物有利于检测出低丰度的靶蛋白。

非贴壁细胞

1. 300g 5min离心出去培养基，用PBS洗涤一次，然后使用含有5%的HBSS或PBS重悬细胞，调整细胞密度（10000-25000 cells/well）确保能裂解后蛋白浓度在0.1—0.5mg/ml。

注意：检测时避免用培养基重悬细胞，因为培养基中一些成分可能会干扰实验结果。例如RPMI1640中含有生物素会对结果造成影响。

2. 【可选】将细胞置于37度培养箱培养1-2小时。（一些信号通路需要激活细胞才能检测到）

3. 向细胞悬液中加入终体积20%的5X Cell Lysis Mix, 300转/min 室温震荡裂解10min。或者离心弃上清用1x Cell Lysis Mix重悬裂解细胞。

B． 检测方案 

1. 向检测孔中加入50ul阳性对照、50ul的1x Cell Lysis Mix作为阴性对照和50ul样品裂解物。

2. 向检测孔加入50ul/well 预先配置的antibody cocktail ,小心封板，室温震荡孵育1h。

注意：检测试剂使用前要平衡至室温。

3. 200ul/well 洗液洗涤3次，最后一次吸水纸上排干。

4. 向每孔加入100ul Detection Reagent 室温孵育10-30min。根据显色来调整时间，高丰度显色快，低丰度显色慢。

5. 每孔加100ul终止液终止。

6. 终止后一小时内450nm酶标仪读板。

实验方案二

本方案适用于在InstantOne 裂解细胞进行实验，也就是ALL-In-One-Well。

A. 样品制备

1. 离心收获细胞用1XPBS+5%BSA调整细胞浓度使10000-25000cells in 20ul（足够许多细胞系使用）。注意：检测时避免用培养基重悬细胞，因为培养基中一些成分可能会干扰实验结果。例如RPMI1640中含有生物素会对结果造成影响。

2. 计算使用InstantOne板条数目，安排实验孔布局。

3. 使用200ul/well无菌蒸馏水洗涤板孔两次，出去空内防腐剂。

4. 向孔中加入20ul细胞悬液。【可选】将细胞置于37度培养箱培养1-2小时。（一些信号通路需要激活细胞才能检测到）

5. 按照实验设计不同时间点，每孔加入20ul 处理剂（例如2X激动剂或拮抗剂）。此外，避免使用培养基。

6. 直接加10ul 5x Cell Lysis Mix 300转/min 室温震荡裂解10min。

B. 检测方案

1. 向检测孔中加入50ul阳性对照、50ul的1x Cell Lysis Mix作为阴性对照。

2. 向检测孔加入50ul/well 预先配置的antibody cocktail ,小心封板，室温震荡孵育1h。a) 注意：检测试剂使用前要平衡至室温。

3. 200ul/well 洗液洗涤3次，最后一次吸水纸上排干。

4. 向每孔加入100ul Detection Reagent 室温孵育10-30min。根据显色来调整时间，高丰度显色快，低丰度显色慢。

5. 每孔加100ul终止液终止。

6. 终止后一小时内450nm酶标仪读板。